(本中文說明書為翻譯稿，僅供參考，應(yīng)以英文版為準)
貨號：3091315 (Sigma-Aldrich : GAHK20)
儲存溫度：2-8℃
產(chǎn)品描述：
作為分析工具的酶已在食品，生化和制藥行業(yè)中得到廣泛使用。酶法具有特異性高，可重現(xiàn)性好，靈敏度高，反應(yīng)快速的特點，因此是分析的理想選擇。由于酶的高度特異性和敏感性，因此可以在幾乎沒有樣品制備或沒有樣品制備的情況下，對粗物質(zhì)進行定量測定食品和其他材料中的葡萄糖。
葡萄糖(HK)檢測試劑盒用于食品和其他材料中葡萄糖的定量、酶法測定。該試劑盒已應(yīng)用于不同的系統(tǒng)以進行與下列課題有關(guān)的研究：
·HEK細胞中的肝葡萄糖和脂質(zhì)平衡4
·產(chǎn)婦肥胖模型5
·纖維素酶燃料電池轉(zhuǎn)化6
原理：
在己糖激酶催化的反應(yīng)中，葡萄糖被三磷酸腺苷(ATP)磷酸化。然后，在氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)存在下，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)催化的反應(yīng)中，將6-磷酸葡萄糖(G6P)氧化為6-磷酸葡萄糖酸。在該氧化過程中，等分子量的NAD被還原為NADH。因此在340nm處吸光度的增加與葡萄糖濃度成正比。
注意事項和免責聲明：
本試劑僅供科研使用，不能用于藥品、家庭以及其他用途。有關(guān)危險和安全操作規(guī)程的信息，請參閱安全數(shù)據(jù)表。
試劑盒組成：
1、葡萄糖(HK)檢測酶試劑
• 用20ml水溶解小瓶內(nèi)粉劑。
• 加水后，立即蓋緊瓶塞，并反轉(zhuǎn)混勻數(shù)次。
• 不可震動。
• 加20ml水溶解后，每瓶溶液含有1.5 mM NAD，1.0 mM ATP，1.0 U/ml G6PDH；并含有防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀。
小瓶粉劑保存于2-8℃。出現(xiàn)以下情況應(yīng)丟棄試劑：
• 小瓶粉劑受潮結(jié)塊。
• 加水后不能充分溶解。
• 水溶液出現(xiàn)渾濁。
在沒有可見的微生物生長的情況下，試劑水溶液比較穩(wěn)定。在18–26℃下保存7天，在2–8℃下至少保存4周。以水作為空白參照，如果新配制的溶液在340nm處的吸光度大于0.350，則該試劑溶液不適合使用。
2、葡萄糖標準溶液
• D-葡萄糖，1.0 mg/mL溶于0.1%的苯甲酸。
• 即用型標準溶液，符合NIST(美國國家標準技術(shù)研究所標準)標準。
• 在2-8℃穩(wěn)定至少六個月。
• 如果出現(xiàn)混濁，請丟棄。
儀器：
1、分光光度計：可在340nm下測定吸光度。
2、量杯。
3、移液器：能夠準確分配10 μL至1.0 mL的體積。
操作步驟：
樣品制備：
液體：
• 用去離子水將樣品稀釋至葡萄糖濃度為0.05-5mg/mL。
• 如有必要，對溶液進行過濾或去蛋白處理以使其澄清。
• 樣品葡萄糖含量較低且顏色較深時，應(yīng)予以脫色處理。
• 含碳酸或發(fā)酵樣品，須脫氣處理。
固體：
• 稱量0.1mg樣品。
• 用去離子水提取樣品。可以將溶液加熱(<75℃)以幫助萃取。
• 用去離子水稀釋提取液品至葡萄糖濃度為0.05-5mg/mL。
• 如有必要，對溶液進行過濾或去蛋白處理以使其澄清。
測定
• 吸取相當于0.5-50μg葡萄糖的溶液。
• 為使ΔA340在0.03-1.6之間，必要時可重復(fù)測定并改變?nèi)芤后w積。
• 將以下溶液吸取到相應(yīng)的試管中。
| 試管 | 葡萄糖檢測試劑(ml) | 樣品體積(μl) | 去離子水(ml) |
| 空白樣品 | - | 同測試 | 1.0 |
| 空白試劑 | 1.0 | - | 同測試 |
| 測試 | 1.0 | 10-200 | - |
• 混勻各試管，在室溫(18-35℃)下孵育15分鐘。
• 用去離子水調(diào)零，測量340nm吸光度。
計算
總空白必須考慮到樣品和葡萄糖測定試劑對吸光度的影響。
ATotal Blank = ASample Blank + AReagent Blank
ΔA = ATest –ATotal Blank
TV = 總檢測體積 (mL)
SV = 樣品體積 (mL)
葡萄糖分子量 = 180.2 g/mole 或等效于 180.2 g/moles
F = 制樣稀釋倍數(shù)
ε= NADH 在340nm處的毫摩爾消光系【毫摩爾-1 cm-1 或等效于 (mL/μmoles)(1/cm)】
d = 光徑 (cm) = 1 cm
1,000 = 微克到毫克的換算系數(shù)
參考文獻：
1、Bondar, R.J.L., and Mead, D.C., Clin、Chem., 20(5), 586-590 (1974).
2、Kunsst, A、et al., Methods of Enzymatic Analysis, 3rd Edition (H.U、Bergmeyer, ed.)、Academic Press (New York, NY), Vol、2, pp、163-172 (1984).
3、Southgate, D.A.T., Determination of Food Carbohydrates、Applied Science Publishers (London, UK: 1976).
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5、Chen, J.-R、et al., Endocrinology, 157(11), 4172-4183 (2016).
6、Chen, Q、et al., J、Biotech., 263, 30-35 (2017).
