一、認識體外診斷
體外診斷(IVD)是指在人體外通過對人體的血液等組織及分泌物進行檢測獲取臨床診斷信息的產品和服務，可提供80%左右的臨床診斷信息，目前，已經成為人類疾病預防、診斷、治療日益重要的組成部分。
二、體外診斷試劑的標準
體外診斷試劑是按醫療器械管理要求的，包括在疾病的預測、預防、診斷、治療監測、預后觀察和健康狀態評價的過程中，用于人體樣本體外檢測的試劑、試劑盒、校準品、質控品等產品。可以單獨使用，也可以與儀器、器具、設備或者系統組合使用。
由于體外診斷試劑在人的體外診斷過程中的重要作用，NMPA（原cFDA）對體外診斷試劑的產品標準有著嚴格的規定和要求，如準確度，精密度，重復性，再現性，以及最低檢測限和靈敏度等。
三、體外診斷試劑的特別注意——微生物污染
微生物是造成體外診斷試劑污染的主要來源之一。如何預防微生物污染，保證檢測試劑的精確度？如何保證產品在保質期內的品質？
防腐劑為我們提供了有效的解決方案，它是一類能夠殺滅或抑制微生物生長的化學物質，在液體試劑中發揮著重要的防腐作用。
四、防腐劑的作用機理
防腐劑是能夠殺滅或抑制微生物，特別是細菌和真菌生長的化學物質。它不是殺菌劑，沒有很強的即時殺滅效果，只有在足夠濃度并與微生物直接接觸的情況下才能發揮作用。通過作用于微生物的細胞膜、細胞壁及酶等多個靶點，破壞細胞的分裂，抑制微生物的生長和繁殖，達到防腐的目的。實際上，防腐劑主要是對酶活力或對細胞原生質部分的遺傳微粒結構產生影響的。例如，硫柳汞作用于巰基酶，而慶大霉素則作用于核糖體。總之，防腐劑是通過抑制細胞中基礎代謝酶的合成或重要生命物質核酸和蛋白質的合成，起到阻礙細胞生長的作用。
五、防腐劑的一般選擇原則
防腐劑的種類很多，如酸堿及其鹽類、中性化合物類、汞化合物類、季胺化合物類等。防腐劑對微生物繁殖體有殺滅作用，但對芽孢則使其不能發育為繁殖體而逐漸死亡。不同類型的防腐劑其作用機理也不盡相同，如醇類能使病原微生物蛋白質變性；苯甲苯酸、尼泊金類等則能與病原微生物酶系統結合，競爭其輔酶；陽離子表面活性劑等則是通過降低表面張力作用，增加菌體細胞膜的通透性。
優良的防腐劑應具備以下特性：
① 加入防腐劑應能有效抑制在試劑盒制備、保存和使用過程中最有可能污染的一種或多種微生物的生長；防腐劑應對大多數細菌、真菌及酵母有較強的抑制作用；
② 防腐劑在試劑中有足夠的溶解度，以保證其在兩相或多相體系的試劑中具有足夠濃度；
③ 在試劑盒的有效期內，防腐劑應非常穩定，不會因化學降解或揮發而降低濃度；防腐劑本身的理化性質和抗微生物性質應穩定，不易受熱和樣品pH值的影響，在長期貯存時不分解失效、不揮發，不沉淀，不與包裝材料起作用；
④ 防腐劑不與試劑盒中的任何成分發生反應，不會影響試劑盒的檢測效果或防腐劑的效果；
⑤ 使用成本低，容易獲得。
六、常用的防腐劑分類
1、疊氮鈉(sodiumazide．NaN3)
疊氮鈉是體外診斷試劑中最常用的防腐劑之一，可抑制細菌生長，溶于水、液氨，不溶于乙醚，微溶于乙醇，用量一般為0.1%一0.5%。
疊氮鈉優缺點：
多數情況下行之有效，但由于其含有氨基，會干擾辣根過氧化物酶(HRP)、超氧化物歧化酶、觸酶等多種酶，所以一般含有HRP的試劑都不建議使用。同理，一般不用于抗體及酶免實驗中的標本保存。
另外，它能阻斷細胞的電子傳遞鏈，對許多生物體都有毒性，因此也不適用于活體實驗。同時，疊氮鈉與氰化物相似，屬于劇毒化合物，半數致死量為27mg/kg(大鼠，經口)，對細胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使體內氧合血紅蛋白形成受阻，有顯著的降壓作用。急性中毒出現頭暈、頭痛、全身無力、血壓下降、心動過緩和昏迷。除對眼和皮膚有刺激性外，還可經吸入、口服或皮膚吸收引起中毒死亡，而且遇高熱或劇烈震動能強烈爆炸，使用時應十分注意安全。出于安全方面的考慮，疊氮鈉的使用日益受限。
2、硫柳汞(thiomersalatum，C9H902HgNaS)
硫柳汞作為防腐劑已有60多年歷史，曾廣泛用于生物制品中的疫苗及體外診斷試劑。硫柳汞稍有特殊臭味，微有引濕性，遇光易變質，易溶于水、乙醇，不溶于乙醚和苯，用量為0.001%～0.01%。它對革蘭陽性和陰性菌均有很強的抑菌能力，為廣譜抑菌劑。
硫柳汞優缺點：
其作用機理為重金屬離子與菌體中酶蛋白的巰基結合而使酶失去活性，但對細菌抗原和血清蛋白的損害極其微弱，不能與酸、碘、鋁等重金屬鹽或生物堿配伍。
硫柳汞為含汞化學物質，汞含量占到分子質量的50%，代謝或降解產物為乙基汞和硫代水楊酸鹽，乙基汞是由二甲基汞降解的有機汞。由于少量有機汞在理論上具有神經毒性，因此硫柳汞的使用安全問題深受人們關注。
3、慶大霉素(gentamicin，C21H43N507)
慶大霉素是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發酵產生的氨基糖苷類抗生素，是由22一脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成的多組分混合物，并以C族復合物為主。其作用機理是直接與30S核糖體亞單位16SrRNA解碼區的A部位結合，從而導至菌體死亡。
慶大霉素優缺點：
它的抗菌譜較廣，對綠膿桿菌、大腸桿菌、產氣桿菌、克雷伯桿菌、奇異變形桿菌、某些吲哚變形桿菌、某些奈瑟菌、某些無色素雷桿菌和志賀菌等革蘭陰性菌有抗菌作用，對革蘭陽性菌中的金黃色葡萄球菌也有很強的抗菌作用。（梅里埃生產的HIV診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L硫酸慶大霉素和0.2ml/L肉桂醛。）
但抗生素的缺點是容易產生耐藥性，Jakobsen等曾報道了120株對慶大霉素耐藥的大腸埃希菌的最小抑菌濃度(MIC)和耐藥機制的關系。
4、ProClin® 防腐劑（推薦使用）
ProClin是商品化的異噻唑啉酮類防腐劑，是2種異噻唑啉酮類化合物的混合物，并含有一定量的硝酸鎂及氯化鎂。此類防腐劑是非常高效的防腐劑，對各種細菌、霉菌、酵母及藻類有很強的抑制作用，使用濃度為0.1%～0.02%(活性成分約為1.5%)。其作用機理為2種活性成分在與細胞膜接觸幾分鐘后，可立即滲透到膜內并抑制細胞內酶的活性，從而抑制細胞生長代謝、大分子合成，引起細胞內能量水平迅速下降；由于能量體系的崩潰，細胞不能合成日常代謝所需要的化合物，從而導至菌體死亡。
ProClin® 防腐劑優缺點：
這類防腐劑能與氯及大多數陰、陽離子及非離子表面活性劑混溶，且在較高的使用濃度下不會影響酶活性。pH適用范圍廣(pH2～8.5)，化學穩定性好。經實驗室檢測，在25℃下保存2年，該防腐劑的活性組分僅損失3％，與水可以任意比混合。ProClin®系列防腐劑具有多標靶作用位點，因此大大降低了因變異產生的微生物的耐藥性，是一種理想的可替代硫柳汞、疊氮化鈉和慶大霉素的生物防腐劑。
但遇銨、亞硫酸鹽、強還原劑和強堿性會降低其活性，在過量使用下有一定的刺激性和致敏性。
下面我們將著重來講述ProClin®系列防腐劑。
為解決生物樣本處理過程中保存期短的問題，SUPELCO公司（現默克生命科學下屬的子品牌）推出新一代高效生物防腐劑ProClin™ 150，200，300，5000，可以有效地控制體外診斷試劑中微生物的生長。當濃度達到0.02%條件下，ProClin®系列防腐劑具有廣譜抗菌活性，能在比較長的時間內抑制細菌、真菌和酵母菌等微生物的生長；同時，它又能保持體系中酶的活性，因此它是一種理想的可替代硫汞撒、疊氮化鈉和慶大霉素等生物防腐劑。
目前，傳統的防腐劑由于劇毒、效率低的原因，已逐漸被新型防腐劑ProClin®防腐劑替代，并已被廣泛用于超過1000種FDA認證的體外診斷試劑盒。
ProClin® 防腐劑的主要特點
• 廣譜抗菌性，作用速度極快
• 與主要的酶及誘導劑兼容
• 不影響抗體結合
• 易于使用的水溶性液體,在極低濃度下依然有效
• 在很大批的pH范圍內也能保持極佳的穩定性
• 使用HPLC即可測定活性組份(需要HPLC標準品)
• 在推薦使用濃度范圍內，ProClin®不會引起任何危害健康、毒性及后處理問題
* 硫柳汞和疊氮化鈉為劇毒品，作為防腐劑使用會極大地危害人體健康。
ProClin® 系列防腐劑作用原理
ProClin®的主要活性組份為兩種異噻唑啉酮：
2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)；
5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)。
在與微生物接觸后的數分鐘內，活性組份就能滲透過細胞壁從而抑制Krebs循環中某些特定酶的活性(如下圖紅色箭頭所示)。微生物的生長、大分子合成及呼吸鏈反應被有效的抑制，最終導致細胞死亡。ProClin®系列防腐劑具有多標靶作用位點，因此大大降低了因變異產生的微生物的耐藥性。隨著KREBS循環被阻斷，細胞產生能量和合成酶等生物活性物質的能力迅速下降，但其使用劑量卻保持比較低的水平對人畜無害。
