為啥要學習使用高效液相色譜柱？
色譜柱的使用和保養：液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路，建立高效液相色譜柱日常維護與保養規程，保證能正常使用。
液相色譜柱的安裝
1、液相色譜柱的結構：
（1）液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。
柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時柱壓不高于70kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。空柱各組件均為不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。
密封環：位于接頭螺旋環內壁的彈性環，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。
（2）柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。
正相柱：
多以硅膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10μm的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：
主要是以硅膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3-10μm之間。
2、色譜柱的安裝：
（1）拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。
（2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
（3）按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如，條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57 mm、內徑為0、1～0.3 mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止。
液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。
1、樣品的前處理：
（1）最好使用流動相溶解樣品；
（2）使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質；
（3）使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質；
2、流動相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此，要求流動相具備以下的特點：
（1）流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
（2）流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
（3）流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時，降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
（4）流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應，如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
（5）流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
（6）在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、 流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mL/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8mL/min為佳。當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如，使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
4、 流動相使用注意事項：
（1）由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
（2）對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。
（3）含水流動相最好在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。
（4）流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質。
（5）使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
液相色譜柱的保存
1、反向色譜柱實驗后的保養：
使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。
2、長期保存色譜柱：
如，色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下，對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水(含防腐劑疊氮化鈉或硫柳汞)中，并將堵頭堵上，儲存溫度最好是室溫。
液相色譜柱的再生
因為，色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說是柱效的下降。
1、反向柱的再生：
依次采用20～30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90(V/V)，乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
2、正相柱的再生：
依次以20～30倍的色譜柱體積正己烷、異丙醇(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高)、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意以上溶劑必須嚴格脫水。
3、離子交換柱的再生：
長時間在緩沖溶液中使用和進樣，將導致色譜柱離子交換能力下降。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
特別說明：
再生過程必須隨時關注柱壓變化，柱壓過高易導致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時要保證再生時間足夠。再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統色譜儀器進行，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。
液相色譜柱常見問題分析與解決方案
1、使用一段時間后柱壓過高：
解決方案：首先查看是否HPLC系統原因，排除系統原因后，原因基本是由于實驗過程中雜質在柱中的累積。盡量完善操作條件，做完樣品后要及時沖洗干凈，如緩沖鹽的流動相一定要用高比例的水溶液(如，90%)沖洗完全后再用有機相保存。
2、篩板堵塞與柱頭塌陷：
解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20分鐘左右，再用純水超聲20分鐘左右，重新裝入色譜柱。
3、色譜柱頭的填料被樣品污染：
解決方法：
如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲。
4、色譜柱內緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出：
解決方法：
如確定是鹽結晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
注意事項：
1、無論何時，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動相長時間(30min以上)走空，否則易使色譜柱干涸且帶入大量幾乎無法排出的氣泡，甚至導致柱床局部塌陷或中部開裂。
2、使用與保存時，嚴禁用力甩，絕對杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導致柱床機械性損壞，則再無再生可能。
3、當柱子和色譜儀聯結時，閥件或管路一定要清洗干凈；
4、避免使用高粘度的溶劑作為流動相；
5、進樣樣品要全溶解；
6、大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2～7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍；
7、每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；
8、每天分析測定結束后，都要用適當的溶劑來清洗柱；
9、若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉。
