Western Blot(簡(jiǎn)稱WB)，蛋白質(zhì)免疫印跡法，是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識(shí)別蛋白的特性，通過(guò)顯色技術(shù)，以達(dá)到檢測(cè)目的蛋白的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于定性檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，活性分析與鑒定。該實(shí)驗(yàn)步驟多，關(guān)鍵點(diǎn)多，耗時(shí)長(zhǎng)，每個(gè)步驟可能都影響最終的結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)各種問(wèn)題。本文對(duì)WB實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的各種問(wèn)題進(jìn)行歸納總結(jié)，并給出相應(yīng)的解決方法，以便了解WB實(shí)驗(yàn)中的注意點(diǎn)和規(guī)范操作的必要性，同時(shí)對(duì)WB出現(xiàn)的問(wèn)題分析和解決提供參考。
1、無(wú)信號(hào)，沒(méi)有陽(yáng)性條帶
WB結(jié)果中常出現(xiàn)白板或者條帶無(wú)信號(hào)響應(yīng)現(xiàn)象，如圖1。我們針對(duì)出現(xiàn)該現(xiàn)象可能的原因主要從抗體，抗原，實(shí)驗(yàn)操作和緩沖液幾方面進(jìn)行分析。
圖1 沒(méi)有陽(yáng)性條帶案例
(1) 抗體相關(guān)原因
WB中所用到抗體包括一抗和二抗，在該問(wèn)題上，兩個(gè)抗體方面可能存在的原因以及相對(duì)應(yīng)的解決方法，歸納總結(jié)在表1。
表1 抗體相關(guān)原因
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 二抗選用不恰當(dāng) | 選擇與一抗相匹配的二抗類型，二抗需和一抗宿主的物種相同 |
| 無(wú)足夠量抗體結(jié)合目標(biāo)蛋白 | 降低一抗稀釋度；使用效價(jià)高的一抗；延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間； 膜充分浸潤(rùn)在液體中。 |
| 儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)或儲(chǔ)存條件不當(dāng)導(dǎo)致抗體失活 | 選擇在有效期內(nèi)的抗體；工作液現(xiàn)配現(xiàn)用 |
(2)抗原相關(guān)原因
抗原即所需要檢測(cè)目的蛋白，其相關(guān)原因可能是未被一抗識(shí)別或者是抗原量不足引起，相對(duì)應(yīng)解決辦法見(jiàn)表2。
表2 抗原相關(guān)原因
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 一抗不識(shí)別待檢測(cè)的目的蛋白 | 參照數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比抗原序列和蛋白序列，選擇合適一抗，確保會(huì)發(fā)生特異性反應(yīng) |
| 抗原量不足或降解 | 每條泳道上樣量不低于 20-30 ug, 使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 |
(3)實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)原因
實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果也至關(guān)重要，且需要重復(fù)摸索。無(wú)條帶出現(xiàn)可能是目標(biāo)蛋白未從膠轉(zhuǎn)移至膜上或者洗膜過(guò)度，具體分析見(jiàn)表3。
表3 實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)原因
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 轉(zhuǎn)膜不充分 | 使用麗春紅染膜或使用考馬斯亮藍(lán)染膠檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果；檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確； 優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件；使用小孔徑膜，防止轉(zhuǎn)膜過(guò)度 |
| 洗膜次數(shù)過(guò)多 | 減少洗膜次數(shù)，洗膜時(shí)間和溫度 |
(4)緩沖液相關(guān)原因
實(shí)驗(yàn)中用到多種緩沖液，緩沖液的選擇和保存，以及選擇合適的顯色方式都很重要。無(wú)目標(biāo)蛋白出現(xiàn)可能與緩沖液有關(guān)的原因和解決方法見(jiàn)表4。
表4 緩沖液相關(guān)原因
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 封閉液與一抗或二抗有交叉反應(yīng) | 使用溫和的去污劑如吐溫，或更換封閉液 |
| 緩沖液中含有HRP抑制劑 | 避免疊氮化鈉和HRP一起使用 |
| ECL發(fā)光液失活 | 更換新的有效的發(fā)光液 |
| 顯色方式選擇 | 延長(zhǎng)曝光和顯色時(shí)間；ECL顯色比DAB顯色靈敏度高5-10倍。 |
2、有陽(yáng)性條帶，但條帶信號(hào)弱
WB結(jié)果中可能出現(xiàn)有目標(biāo)蛋白條帶，但是目標(biāo)條帶在膜上顏色較淺，如圖2。該現(xiàn)象原因與 1(無(wú)信號(hào)，沒(méi)有陽(yáng)性條帶)中無(wú)目標(biāo)條帶較為相似，可能導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因我們也從4個(gè)方面進(jìn)行分析，并給出相應(yīng)的解決方法，具體分析見(jiàn)表5。
圖2 條帶信號(hào)弱案例
表5 條帶信號(hào)弱可能原因和解決方法
| 問(wèn)題所在 | 可能原因 | 解決辦法 |
| 抗體相關(guān) | 抗體濃度過(guò)低 | 提高抗體濃度 |
| 抗體和抗原親和力較低 | 提高抗體濃度 | |
| 抗體活性較低 | 選擇在有效期內(nèi)的抗體；工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)放置 | |
| 抗原相關(guān) | 抗原量不足 | 檢查待測(cè)樣本，增加上樣量 |
| 實(shí)驗(yàn)操作相關(guān) | 轉(zhuǎn)膜不充分 | 使用麗春紅染膜或使用考馬斯亮藍(lán)染膠檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果； 檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確；優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件；使用小孔徑膜，防止轉(zhuǎn)膜過(guò)度 |
| 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度；延長(zhǎng)孵育時(shí)間 | |
| 洗膜過(guò)度 | 縮短洗膜時(shí)間 | |
| 封閉過(guò)度 | 減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型 | |
| 曝光時(shí)間過(guò)短 | 增加曝光時(shí)間 | |
| 緩沖液相關(guān) | 可能含有HRP抑制劑 | 避免疊氮鈉和HRP一起使用 |
3、條帶或位置異常
條帶或者位置異常是指條帶形狀異常和條帶在膜上與理論位置不一致。條帶形狀異常常與電泳問(wèn)題有關(guān)，SDS-PAGE電泳的質(zhì)量至關(guān)重要。條帶位置異常可能是蛋白出現(xiàn)聚體或被修飾，蛋白出現(xiàn)降解有關(guān)。下面就可能出現(xiàn)的各個(gè)問(wèn)題結(jié)合實(shí)際案例詳細(xì)討論。
(1) 微笑條帶
電泳條帶或整體出現(xiàn) “︶ ”形狀，可能原因主要包括兩方面。一是電泳速度過(guò)快，可通過(guò)減少電壓等減慢電泳速度。二是電泳溫度過(guò)高，使得膠變形，可在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳或者改變電泳pH。
(2)皺眉條帶
與微笑狀條帶相反，條帶成現(xiàn)“︵”皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。可通過(guò)調(diào)整裝置來(lái)避免該問(wèn)題。
圖3 皺眉條帶案例
(3)某條條帶變形
WB結(jié)果中其它條帶均正常，某條條帶出現(xiàn)變形，出現(xiàn)該現(xiàn)象可能的原因是SDS-PAGE膠中有氣泡或者不溶性顆粒。我們?cè)谂淠z過(guò)程中要小心，使用無(wú)雜質(zhì)的液體。
(4)啞鈴狀條帶
結(jié)果中出現(xiàn)條帶呈現(xiàn)啞鈴狀，該現(xiàn)象可能有兩個(gè)原因?qū)е隆Ｒ皇怯捎谂渲媚z有問(wèn)題，膠凝固后不均一，可通過(guò)重新配置膠，確保膠質(zhì)量無(wú)問(wèn)題來(lái)避免該現(xiàn)象出現(xiàn)。二是樣品可能含有過(guò)多雜質(zhì)，我們?cè)跇悠肥褂们皩?duì)其進(jìn)行離心，以去除過(guò)多雜質(zhì)。
圖4 啞鈴狀條帶案例
(5)條帶粘連
條帶粘連是不同孔目標(biāo)條帶連在一起，中間無(wú)間隔，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是上樣量太多，或者是制膠問(wèn)題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。可通過(guò)減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來(lái)避免該問(wèn)題。
圖5 條帶粘連案例
(6)分子條帶大小不對(duì)
分子條帶大小，即條帶位置異常，主要包括三種情況。第一種是出現(xiàn)高于目標(biāo)蛋白較多的條帶，該現(xiàn)象可能是由于蛋白未充分變性，導(dǎo)致蛋白形成二聚體或者多聚體。為避免該現(xiàn)象，可在實(shí)驗(yàn)之前加入新配的DTT或b-ME，重新加熱使得蛋白充分變性或者直接使用新的蛋白樣本。第二種是出現(xiàn)略高于目標(biāo)蛋白的條帶，該現(xiàn)象可能是由于蛋白被修飾，如糖基化/磷酸化等，可導(dǎo)致分子量增加。解決方法是嘗試使用酶去除可能的蛋白修飾。第三種是出現(xiàn)比目標(biāo)蛋白略低的條帶，如圖4-12，該現(xiàn)象可能是由于蛋白翻譯后剪切或者降解。在樣品準(zhǔn)備時(shí)候要在冰上操作或者是加入更過(guò)蛋白酶抑制劑，以防止蛋白降解。
4、 高背景
高背景是WB中常出現(xiàn)的問(wèn)題，本文將高背景分為兩類討論，包括均一性高背景和斑點(diǎn)或發(fā)泡式或閃爍式非均一性高背景。下面針對(duì)兩種情況均從抗體，實(shí)驗(yàn)操作和緩沖液方面進(jìn)行分析討論，并給出相應(yīng)的解決方法，以減少背景，得到漂亮真實(shí)可靠的WB結(jié)果。
(1)均一性高背景
均一性高背景在實(shí)驗(yàn)中常常出現(xiàn)，可能導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因較多，均總結(jié)于表6中，并給出相應(yīng)的解決方法。
圖6 均一性高背景案例
表6 均一性高背景原因和解決方法
| 問(wèn)題所在 | 可能原因 | 解決辦法 |
| 抗體相關(guān) | 一抗，二抗?jié)舛容^高 | 提高一抗，二抗稀釋比，優(yōu)化稀釋條件 |
| 一抗，二抗和封閉液結(jié)合 | 更換封閉液；更換二抗或降低二抗?jié)舛?/td> | |
| 儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)或儲(chǔ)存條件不當(dāng)導(dǎo)致抗體失活 | 選擇新的抗體 | |
| 實(shí)驗(yàn)操作相關(guān) | 封閉溫度過(guò)高，封閉不完全 | 封閉液的選擇與優(yōu)化；使用5%脫脂奶粉封閉；優(yōu)化封閉時(shí)間和溫度 |
| 膜的問(wèn)題 | 防止膜過(guò)程中干燥；換用NC膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；使用干凈鑷子并戴手套操作 | |
| 孵育中洗膜不充分 | 適當(dāng)增加洗膜時(shí)間和次數(shù)；確保在充分震蕩的條件下孵育膜，并且抗體充分覆蓋膜表面 | |
| 曝光過(guò)度 | 縮短曝光時(shí)間，或等5-10分鐘后重新使用X光片進(jìn)行曝光 | |
| 緩沖液相關(guān) | 緩沖液中去污劑不夠 | 增加TBST中Tween 20的濃度 |
| 轉(zhuǎn)膜液，封閉液等不新鮮或被污染 | 現(xiàn)用現(xiàn)配 |
(2)斑點(diǎn)或發(fā)泡式或閃爍式非均一性高背景
出現(xiàn)非均一性高背景結(jié)果的原因與均一性背景有很多相似之處，也存在差別，如蛋白聚體的影響，非均一性高背景案例圖如圖7所示，可能原因見(jiàn)表7。
圖7 非均一性高背景
表7 非均一性高背景原因和解決方法
| 問(wèn)題所在 | 可能原因 | 解決辦法 |
| 抗體相關(guān) | 抗體濃度太高 | 提高一抗，二抗稀釋度，優(yōu)化稀釋條件 |
| 二抗聚集 | 使用前過(guò)濾二抗或者更換二抗 | |
| 封閉劑中有聚集體 | 使用前過(guò)濾封閉劑或者更換 | |
| 一抗，二抗和封閉液結(jié)合 | 更換封閉液；更換二抗或降低二抗?jié)舛?/td> | |
| 實(shí)驗(yàn)操作相關(guān) | 封閉溫度過(guò)高，封閉不完全 | 封閉液的選擇與優(yōu)化；增加封閉液中蛋白濃度；優(yōu)化封閉時(shí)間和溫度 |
| 膜沒(méi)有正確潤(rùn)濕 | 使用干凈鑷子并戴手套操作；使用足夠液體，膜始終保持濕潤(rùn)； 孵育時(shí)使用脫色搖床；避免膜重疊，相互覆蓋 | |
| 緩沖液相關(guān) | 儀器污染 | 保證所有儀器和用具干凈；確保膜上無(wú)殘留膠 |
| 轉(zhuǎn)膜液，封閉液等不新鮮或被污染 | 現(xiàn)用現(xiàn)配 |
5、 非特異性條帶多
非特異性條帶是指除目標(biāo)蛋白以外的條帶，雜帶較多影響結(jié)果判斷，且結(jié)果不可靠。下面我們結(jié)合實(shí)際案例如圖8，對(duì)其可能原因進(jìn)行分析并找出相對(duì)應(yīng)的解決方法，見(jiàn)表8。
圖8 非特異性條帶多案例
表8 非特異性條帶多可能原因和解決方法
| 可能原因 | 解決方法 |
| 抗體稀釋度問(wèn)題 | 降低上樣量；提高一抗稀釋度。 |
| 抗體未純化 | 使用單克隆或親和層析純化后的抗體，減少非特異條帶 |
| 轉(zhuǎn)膜強(qiáng)度太強(qiáng)，導(dǎo)致雜帶太強(qiáng) | 降低轉(zhuǎn)膜強(qiáng)度(時(shí)間和電流)，使目標(biāo)蛋白上方的蛋白少轉(zhuǎn)移到膜上。 |
| 抗體與蛋白非特異性結(jié)合 | 更換抗體 |
| 封閉不完全 | 增加封閉液中蛋白濃度 |
| 細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)模式分化 | 使用原代或者傳代少的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做參照 |
| 新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式 | 查其文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST查詢，使用說(shuō)明書(shū)報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞株或組織 |
6、其它問(wèn)題
(1)反白現(xiàn)象
反白現(xiàn)象是蛋白條帶中間空白，而周圍背景正常。該現(xiàn)象可能原因是一抗?jié)舛冗^(guò)高，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)，同時(shí)顯色底物處于臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白。可降低一抗和二抗?jié)舛龋蛘吒鼡Q底物來(lái)避免該現(xiàn)象。
(2)條帶中間或周圍出現(xiàn)白圈
條帶中間白圈可能是由于電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡，如圖9。在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中要盡量去除氣泡，使膜，濾紙和膠緊密結(jié)合。同時(shí)，抗體孵育的過(guò)程中，保持膜的充分浸潤(rùn)。
圖9 條帶中間白圈
WB因結(jié)果直觀易分析為蛋白研究中最常用的方法之一，但也因?yàn)槠洳襟E繁雜結(jié)果變幻莫測(cè)成為很多新手的夢(mèng)魘。相信看完本文的小伙伴一定會(huì)有所感悟，把握好基本原則，先做出條帶，再優(yōu)化結(jié)果。好看的結(jié)果千篇一律，有趣的條帶五花八門，遇到問(wèn)題一步一步排除可能存在的問(wèn)題，相信你會(huì)做出好看漂亮的結(jié)果！
