分光光度法是指應用分光光度計的分析方法，具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點。
通常所測樣品溶液濃度下限可達10-6～10-5mol/L，適用于測定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。
一、原理
1.1 物質對光的選擇性吸收
當光束照射到物質上時，光與物質發生相互作用，產生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
1.1.1 溶液顏色的產生
當一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺到的光定義為可見光。
在可見光區，不同波長的光呈現不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。
透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。
1.1.2 光吸收的本質
當一束光照射到某物質或其溶液時，組成該物質的分子、原子或離子與光子發生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態（基態）躍遷到較高能太（激發態），這個作用稱為物質對光的吸收。被激發的粒子約在10-8s后回到基態，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量hυ，與被照射物質粒子的基態和激發態能量之差相當時，才能發生吸收。
不同物質微粒由于結構不同而具有不同的量子化能級，其基態和激發態能量差也不相同。
所以物質對光的吸收具有選擇性。
1.1.3 吸收曲線
吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質對不同波長的光的吸收能力。將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度），然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據。
1.2 光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶質吸收了光能，光的強度就要減弱。
溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著。
該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據，是由實驗觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光系數，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數，數值上等于濃度為1mol/L的吸光物質在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物質吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。
由實驗結果計算ε時，常以被測物質的總濃度代替吸光物質的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數。
在多組分體系中，如果各種吸光物質之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比，即：
T=I/I0因此：A=lg(1/T)
二、主要部件
盡管光度計種類型號繁多，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器、吸收池和檢測系統。
2.1 光源
在測量吸光度時，要求光源發出所需波長范圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，并在一定時間內能保持穩定。在可見光區測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態時會發出波長在320~2500nm之間的連續光譜。
鎢絲燈工作溫度一般為2600～2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩壓電源。
在紫外區測量時，常采用氫燈或氘燈產生波長在180～375nm之間的連續光譜作為光源。
其理想光源應具有覆蓋整個紫外可見光區的連續輻射，強度應比較高，且隨波長變化能量變化不大，但在實際上難以實現。
氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高于氫燈，但欠穩定，波長范圍180～1000nm，常用作熒光分光光度計的激發光源。
2.2 單色器
單色器是將光源發射的復合光分解為單色光的裝置。一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣（一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波長的分析測定，在紫外區必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便于自動化，工作波段廣。
2.3 吸收池
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平面。玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定誤差，其材質對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應做配套性試驗，試驗后標記出放置方向。紫外光區數值不跳為石英。
2.4檢測系統
檢測系統包括檢測器和記錄顯示裝置。檢測器是一種光電轉換設備，將光強度轉變為電信號顯示出來。常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。
光電倍增管利用二次電子發射來放大光電流，放大倍數可高達108倍，應用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內完成對190-800nm波長范圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控制儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。
三、測量條件的選擇
3.1 顯色反應及顯色條件的選擇
進行比色分析或光度分析時，首先要把待測組分轉變成有色化合物，然后進行比色或光度測定。將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。
3.1.1 顯色反應的選擇
顯色反應分兩類，即絡合反應和氧化還原反應，絡合反應是最主要的顯色反應。
選用的原則是：
1）選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光系數ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標志，因此應當選擇生成的有色物質的ε較大的顯色反應。一般來說，當ε為104-105時，可認為該反應靈敏度較高。
2）盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數幾個組分發生顯色反應。
3）顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質最大吸收波長之差稱為對比度，一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
4）反應生成的有色化合物組成恒定，化學性質穩定。
3.1.2 顯色條件的選擇
吸光光度法測定的是顯色反應達到平衡后溶液的吸光度，因此要得到準確的結果，必須從研究平衡著手，了解影響顯色反應的因素，控制適當的條件，使顯色反應完全和穩定。
1）根據溶液平衡原理，有色絡合物的穩定常數越大，顯色劑過量越多，越有利于待測組分形成有色絡合物。但是過量顯色劑的加入有時會引起副反應，對測定反而不利。
2）酸度對顯色反應的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反應的適宜酸度范圍是通過實驗來確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度，改變溶液pH值，測定其吸光度，作出吸光度-pH值關系曲線，選擇曲線平坦部分對應的pH值作為測定條件。
3）顯色反應一般在室溫下進行，有的反應需要加熱，以加速顯色反應，使之進行完全。
4）大多數顯色反應需要經過一定的時間才能完成，其長短與溫度的高低有關，也會受到空氣的氧化或發生光化學反應使眼色顏色減弱。因此必須通過實驗作出在一定溫度下的吸光度-時間關系曲線，得到適宜的顯色時間。
3.1.3 干擾的消除
1）干擾的類型
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將干擾測定。
A.干擾離子本身有顏色
B.干擾離子本身無顏色，但能與顯色劑反應生成穩定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定，若生成的配合物無色，也降低了顯色劑的濃度，影響被測離子與顯色劑的反應，而產生誤差。
C.干擾離子與被測離子反應生成配合物或沉淀，影響被測離子的測定。
2）消除干擾的方法
A.控制溶液酸度。
B.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩定的化合物，使干擾離子不再產生干擾。
C.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
D.選擇適當的工作波長以消除干擾。
E.采用適當的分離方法。
3.2 吸光度測量條件的選擇
3.2.1 入射光波長的選擇
應根據吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。
如顯色劑與鈷絡合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷，則未反應的顯色劑會造成干擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發生吸收。而鈷絡合物則有一吸收平臺。
3.2.2 參比溶液的選擇
1）如果僅待測物與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑作參比溶液。
2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
3）如試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑反應，則當顯色劑無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液，當顯色劑略有吸收時，可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。
3.2.3 吸光度讀數范圍的選擇
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調整被測溶液的吸光度：
1）控制被測溶液的濃度。如改變取樣量，改變溶液的濃縮倍數或稀釋倍數。
2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
四、應用
4.1 應用領域
4.1.1高含量組分測定-示差法
當待測組分含量較高時，測得的吸光度值常常偏離朗伯-比爾定律。即使不發生偏離，也因為通常采用純溶劑作參比溶液（普通光度法），使測得的吸光度太高，超出適宜的讀數范圍而引入較大的誤差。采用示差法就能克服這一缺點。
但應用示差法時，要求儀器光源有足夠的發射強度或能增大光電流放大倍數，以便能調節參比溶液透光度為100%。這就要求儀器單色器質量高，電光學系統穩定性好。
4.1.2 多組分分析
應用紫外可見分光光度法，常常可能在同一試樣溶液中不進行分離而測定一個以上組分。
假定溶液中同時存在兩種組分x和y，其吸收光譜一般有重疊和不重疊兩種情況。
1）不重疊的測定組分相互不產生干擾。
2）若吸收光譜重疊，在波長為λ1和λ2時分別測定吸光度A1和A2，由吸光度值的加和性得到聯立方程，通過解聯立方程求得各濃度值。
4.2 定量方法
紫外可見分光光度分析的定量依據是光吸收定律，但具體操作方法卻有多種
4.2.1 標準曲線法
即工作曲線法，適用于大量重復的樣品分析，是工廠控制分析中應用最多的方法。
根據光吸收定律，對于一種有色化合物，ε是一個定值，若把光程L也固定，那么吸光度A就和溶液的濃度c成正比，也就是說吸光度A和濃度c呈線性關系。
配制一系列適當濃度的標準溶液，顯色后分別測定其吸光度，把吸光度A對濃度c作圖，即得工作曲線。
4.2.2 直接比較法
直接比較法其實質也是工作曲線法，是一種簡化的工作曲線法。
配一個已知被測組分濃度為cs的標樣，測其吸光度為As，在同樣條件下再測未知樣品的吸光度為Ax，通過計算可求出未知樣品的濃度cx。
As=εcsL
Ax=εcxL
由于溶液性質相同，比色皿厚度一樣，所以As/Ax=cs/cx
式中：
cs-已知被測組分的濃度，mol/L；
cx-未知樣品的濃度，mol/L；
As-已知被測組分的吸光度；
Ax-未知樣品的吸光度。
直接比較法簡化了繪制工作曲線的步驟，適用于個別樣品的測定。
操作時應注意配制標樣的濃度要接近被測樣品的濃度，這樣能減少測量誤差。
4.2.3 標準加入法
標準加入法是工作曲線的一種特殊應用。
選擇適當的顯色條件，先測定濃度為cx的未知樣品吸光度為Ax，再向未知樣品中加入一定量的標樣，配置成濃度為cx+Δc1、cx+Δc2……一系列樣品，分別顯色后再測定吸光度為A1、A2……最后在坐標紙上繪圖，以吸光度A為縱坐標，以濃度c為橫坐標，分別畫出Δc1、Δc2所對應的A1、A2等各點，連成直線后延長，與橫軸的交點cx也就是未知樣品的濃度cs。
應用標準加入法時要注意，加入的標樣濃度要適當，使畫出的曲線保持適當角度，濃度過大或過小都會帶來測量誤差。
這種方法操作比較麻煩，不適于作系列樣品分析，但它適用于組成比較復雜，干擾因素較多而又不太清楚的樣品，因為它能消除背景的影響。
4.3 紫外可見分光光度計使用中的注意點
4.3.1 保護光源
光源燈有一定的壽命，儀器不工作時不要開燈，若工作間歇時間短，可不關燈。
一旦停機，則要待燈冷卻后再重新啟動，并預熱15min。
燈泡發黑或亮度明顯減弱或不穩定時，就及時更換。
經經紫外光照射后形成結痕可用無水乙醇去除。
4.3.2 保證合適的工作環境
溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。
不適宜的溫度和濕度可引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降；
造成光柵、反射鏡、聚焦鏡等光學部件的鋁膜銹蝕，產生光能不足、雜散光、噪聲等；
甚至使儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養時應定期加以校正溫度和濕度。
實驗室，特別是地處南方地區的實驗室，應具備四季恒溫的儀器室，配備恒溫設備。
環境中的塵埃和腐蝕性氣體也可以影響機械系統的靈活性、降低各種限位開關、按鍵、光電耦合器的可靠性，也是造成光學部件鋁膜銹蝕的原因之一。
因此必須定期清潔，保障環境和儀器內衛生條件，防塵。
4.3.3 定期除塵、調校
儀器使用一定時間后，內部會積累一定量的塵埃，最好由維修工程師或在工程師指導下定期開啟儀器外罩對內部進行除塵工作，同時將各發熱元件的散熱器重新緊固，對光學盒的密封窗口進行清潔，必要時對光路進行校準，對機械部分進行清潔和必要的潤滑，最后恢復原狀，再進行一些必要的檢測、調校和記錄。
4.3.4 正確使用比色皿
拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
清洗比色皿時，先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。若被比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1:2）浸泡片刻，再用水沖洗。每次做完實驗應立即洗凈比色皿。
比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。
測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿內壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減少測量誤差。
若分光光度計噪音比較大，有可能是光源燈泡使用時間超過壽命期，可更換光源燈泡。
若自檢時提示波長自檢出錯，有可能是自檢過程中打開過儀器樣品室的蓋子，可關上儀器樣品室蓋子，重新自檢。
